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    過氧化氫酶活性測定(高錳酸鉀滴定法)

     過氧化氫酶活性測定(高錳酸鉀滴定法)

    過氧化氫酶普遍存在于植物的所有組織中,其活性與植物的代謝強度及抗寒、抗病能力有一定關系,故常加以測定。
          一、原理   過氧化氫酶(catalase)屬于血紅蛋白酶,含有鐵,它能催化過氧化氫分解為水和分子氧,在此過程中起傳遞電子的作用,過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。可根據H2O2的消耗量或O2的生成量測定該酶活力大小。在反應系統中加入一定量(反應過量)的過氧化氫溶液,經酶促反應后,用標準高錳酸鉀溶液(在酸性條件下)滴定多余的過氧化氫。即可求出消耗的H2O2的量。
          二、材料、儀器設備及試劑
          (一)材料:小麥葉片
          (二)儀器設備:1. 研缽;2. 三角瓶;3. 酸式滴定管;4. 恒溫水浴;5. 容量瓶。
          (三)試劑:1. 10%H2SO42. 0.2 mol/L pH7.8磷酸緩沖液;3. 0.1mol/L 高錳酸鉀標準液稱:取KMnO4AR3.1605g,用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml,再用0.1mol/L 草酸溶液標定;4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大約等于17.6mol/L,取30%H2O2溶液5.68ml,稀釋至1000ml,用標準0.1mol/L KMnO4溶液(在酸性條件下)進行標定;5. 0.1mol/L 草酸:稱取優級純H2C2O4.2H2O 12.607g,用蒸餾水溶解后,定容至1000ml
          、實驗步驟
          (一)酶液提取:取小麥葉片2.5g加入pH7.8的磷酸緩沖溶液少量,研磨成勻漿,轉移至25ml容量瓶中,用該緩沖液沖洗研缽,并將沖洗液轉至容量瓶中,用同一緩沖液定容,4000rpm離心15min,上清液即為過氧化氫酶的粗提液。
          (二)取50ml三角瓶4個(兩個測定,另兩個為對照),測定瓶加入酶液2.5ml,對照加煮死酶液2.5ml,再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2,同時計時,于30恒溫水浴中保溫10min,立即加入10%H2SO42.5ml
          0.1mol/L KMnO4標準溶液滴定,至出現粉紅色(在30min內不消失)為終點。
          、結果計算
          酶活性用每g鮮重樣品1min內分解H2O2mg數表示:
          過氧化氫酶活性(H2O2mg/g/min)=(AB×VT/(W×VS×1.7×t)
          式中:A對照KMnO4滴定ml數;B酶反應后KMnO4滴定ml數;VT提取酶液總量(ml);   

    VS反應時所用酶液量(ml);W樣品鮮重(g);t反應時間(min);
          1.71ml0.1mol/L KMnO4相當于1.7mgH2O2
         過氧化氫酶的活性測定 

      在植物體中, 黃素氧化酶類的代謝產物常包含H2O2,如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸

    作用中的葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、醛氧化酶等。H2O2的積累可導致破壞性的氧化作用,

    而過氧化物酶和過氧化氫酶則可以清除H2O2, 是植物體內重要的活性氧清除系統之一。其活

    性還與植物的抗逆性有密切關系,本實驗利用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性。

        一、原理:過氧化氫酶屬于血紅蛋白酶,含有鐵,它能催化過氧化氫分解為水和分子氧,

    在此過程中起傳遞電子的作用,H2O2則既是氧化劑,又是還原劑。

        R(Fe+2)H2O2=====R(Fe+3OH-)2

        R(Fe+3OH-)2H2O2===R(Fe+2)22H2OO2

        合并上式:2H2O2====2H2OO2

        據此,可根據H2O2的消耗量或O2的生成量測定該酶活力大小。

        在反應系統中加入一定量(反應過量) 的過氧化氫溶液,經酶促反應后,用標準高錳酸

    鉀溶液(在酸性條件下)滴定多余的過氧化氫。

        5H2O22KMnO44H2SO45O22KHSO48H2O2MnSO4

        即可求出消耗的H2O2量。

        二、儀器和用具:研缽、三角瓶50cm3×4、鐵架、酸式滴定管、恒溫水浴、容量瓶

        三、試劑:

        10H2SO40.2mol/l磷酸緩沖液pH7.8

        0.1mol/l高錳酸鉀標準液: 3.1605gKMnO4  (AR) 用新煮沸的蒸餾水配制成1000ml, 用

    0.1mol/l的草酸溶液標定;

        0.1mol/l  H2O2:  市售30H2O2大約等于17.6mol/l,  取30H2O2溶液5.68ml稀釋至

    1000ml,用標準0.1mol/l KMnO4溶液(在酸性條件下)進行標定。

        四、方法:

        1. 酶液提取: 取小麥葉片2.5g加入pH7.8的磷酸緩沖液少量,研磨成勻漿,轉移至25ml

    容量瓶中,將研缽沖洗干凈,沖洗液轉移至容量瓶中,并用同一緩沖液定容,4000rpm離心,

    上清液即為過氧化氫酶粗提液。

        2. 50ml三角瓶4個 (兩個測定兩個對照) , 測定加入酶液2.5ml, 對照為煮死酶液

    2.5ml; 再加入2.5ml 0.1mol/l H2O2,同時計時間,于30℃恒溫水浴中保溫10分鐘,立即加

    10H2SO4 2.5ml

        3. 0.1mol/l KMnO4標準溶液滴定H2O2,至出現粉紅色(在30分鐘內不消失)為終點。

        4. 結果計算:

        酶活性用每克鮮重樣品在10分鐘內分解H2O2的毫克數表示:

        

                                       (A-B)*Vt/V1*1.7

        酶活(酶分解的H2O2 mg/g鮮重)=-------------------

                                             W

        式中:  A-----對照用KMnO4 ml數        B-----酶反應后KMnO4滴定ml

                Vt----酶液總量ml         1----反應所用酶液量ml      -----樣品鮮重(g)

                1.7----1ml 0.1mol/l KMnO4相當于1.7mg H2O2

          [注意].所用KMnO4溶液及H2O2溶液使用前要經過標定,0.1mol/l H2O2要新配制。

    過氧化物酶活性的測定(比色法) 

    過氧化物酶是植物體內普遍存在的、活性較高的一種酶,它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有密切關系,在植物生長發育過程中,它的活性不斷發生變化,因此測量這種酶,可以反映某一時期植物體內代謝的變化。 

    一、原理 

    在有過氧化氫存在下,過氧化物酶能使愈創木酚氧化,生成茶褐色物質,該物質在 470 nm 處有最大吸收,可用分光光度計測量 470 nm 的吸光度變化測定過氧化物酶活性。 

    二、實驗材料、試劑與儀器設備 

    (一)實驗材料 

    馬鈴薯塊莖。 

    (二)試劑 

    1 . 100 mmol / L 磷酸緩沖液 pH6.0 (見附錄)。 

    2 .反應混合液: 100 mmol / L 磷酸緩沖液( pH6.0 ) 50 mL 于燒杯中,加入愈創木酚 28 μl ,于磁力攪拌器上加熱攪拌,直至愈創木酚溶解,待溶液冷卻后,加入 30 % 過氧化氫 19 μl ,混合均勻,保存于冰箱中。 

    (三)儀器設備 

    分光光度計,研缽,恒溫水浴鍋, 100 mL 容量瓶,吸管, 離心機。 

    三、實驗步驟 

    1 .稱取植物材料 1 g ,剪碎,放入研缽中,加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿,以 4000 r / min 離心 15 min ,上清液轉入 100 mL 容量瓶中,殘渣再用 5 mL 磷酸緩沖液提取一次,上清液并入容量瓶中,定容至刻度,貯于低溫下備用。 

    2 .取光徑 1 cm 比色杯 2 只,于 1 只中加入反應混合液 3 mL 和磷酸緩沖液 1mL ,作為對照,另 1 只中加入反應混合液 3 mL 和上述酶液 1mL (如酶活性過高可稀釋之),立即開啟秒表記錄時間,于分光光度計上測量波長 470 nm 下吸光度值,每隔 1min 讀數一次。 

    四、結果計算 

    以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小,即以 ΔA 470 /[min · g (鮮重) ] 表示之。也可以用每 min 內 A 470 變化 0.01 為 1 個過氧化物酶活性單位( u )表示。 

    過氧化物酶活性 [u/ ( g · min ) ]= 

    式中: Δ 470 ——反應時間內吸光度的變化。 ——植物鮮重, g 。 

    V T ——提取酶液總體積, mL 。 

    V s ——測定時取用酶液體積 , mL 。 

    ——反應時間, min 。 

    蒲圻貝母Fritillaria puqiensis G.D.Yu et G.Y.Chen是貝母屬中一新種,其有效成分生物堿含量較高,止咳效果顯著[1,2]。其中的蒲貝酮堿的效果與可待因相似,且無成癮性,已被國家新藥辦立項進行一類新藥開發。但由于蒲圻貝母以野生為主,連年的采挖已使其資源逐漸枯竭,難以為新藥開發提供資源保證,為此我們對其進行了組織培養。蒲圻貝母鱗莖切塊培養22d左右,可直接從切片邊緣長出多個小鱗莖,以后小鱗莖逐漸長大。為了探討鱗莖發生的機理,并為研究提高組培貝母鱗莖的生長率,誘發多鱗莖形成的方法,我們在培養的不同時期取材,對鱗莖形成過程中的可溶性蛋白,過氧化物酶及酯酶同工酶的酶譜變化進行了分析。

    1 材料和方法
    1.1 材料
      蒲圻貝母F.puqiensis取自湖北省蒲圻市,經中國藥科大學生藥教研室李萍博士鑒定。
      新鮮的蒲圻貝母鱗莖在流水下沖洗3h,0.1%氯化汞表面消毒20min,無菌水沖洗5次,切成0.5cm×0.5cm×0.2cm的小塊接種于MS附加BA 2mg/L-1,IAA 1mg/L-1的培養基上,在25℃黑暗條件下培養,獲得無菌材料。分別在培養的不同時間取材,并以未進行培養的新鮮貝母鱗莖為對照,進行可溶性蛋白,過氧化物酶及酯酶同工酶酶譜分析。
    1.2 方法
    1.2.1 試劑的配制與凝膠的制備:參考文獻[3]的方法。分離膠濃度為7.5%,間隔膠濃度為2.5%。
    1.2.2 樣品制備:稱取新鮮的貝母鱗莖1g,在低溫冰箱內放置1h后,加少許石英砂,加3ml提取緩沖液(0.1mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液,其中含0.5mol/L蔗糖,0.06mol/L抗壞血酸,0.006mol/L半胱氨酸),在低溫下研磨后離心 20min,5000r/min,取上清液置-20℃下保存。
    1.2.3 電泳:采用垂直板式聚丙烯酰胺凝膠電泳,加入溴酚藍作為指示染料。穩定電流強度為12~24mA。可溶性蛋白的點樣量為50μl,用含0.05%考馬斯亮藍的12.5%三氯乙酸溶液染色4h。過氧化物同工酶的點樣量為30μl,用抗壞血酸-聯苯胺染液染色,其組成為抗壞血酸70.4mg,聯苯胺儲存液20ml(2g聯苯胺溶于18ml文火加熱的冰醋酸中,再加水72ml),0.6%過氧化氫20ml,水60ml。酯酶同工酶的點樣量為50μl,按薛應龍[4]方法,即凝膠在0.2mol/L,Tris-HCl緩沖液(pH 7.1)預浸10min,然后移入含有7%醋酸-α-萘酯的丙酮溶液0.5ml,堅牢藍12.5mg,0.2mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.1)1ml,水23.4ml的染色液中染色10~30min,棕紅色的同工酶譜帶即呈現。

    2 結果與分析
      按譜帶顏色的深淺程度將其劃分為重帶、次重帶、輕帶,并按遷移率的大小劃分為3個區,Rf在0.1~0.3為慢速區(A),在0.4~0.6為中速區(B),在0.7~0.9為快速區(C)。

    關鍵字:過氧化氫酶活性測定(高錳酸鉀滴定法)
    錄入時間:2012-6-20 Hits:5783

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